Uso de qPCR para detectar la contaminación de aguas residuales

A los higienistas industriales y profesionales de la salud ambiental se les pide con frecuencia que determinen si existe contaminación fecal después de desbordamientos de aguas residuales y después de inundaciones por tormentas. Muchos han utilizado las pruebas tradicionales de bacterias indicadoras fecales (BIF) que cultivan coliformes totales, coliformes fecales, E. coli, o Enterococos Para estas aplicaciones, si bien es ampliamente reconocido que estas pruebas no son lo suficientemente específicas ni sensibles como para considerarse buenos indicadores de contaminación fecal, hasta hace poco eran las únicas disponibles. Con la comercialización de la reacción en cadena de la polimerasa (específicamente la PCR cuantitativa o qPCR), las pruebas genómicas y la investigación adicional sobre el uso de otros organismos indicadores de contaminación fecal, ahora contamos con pruebas más sensibles y específicas para determinar la presencia de contaminación fecal o de aguas residuales.

Las heces contienen una cantidad extraordinaria de microorganismos: bacterias, virus, protozoos y helmintos, algunos de los cuales son patógenos. Sin embargo, no es técnicamente posible cultivar todos los tipos de organismos patógenos presentes en las heces, y hacerlo resultaría prohibitivo en términos de costo. Debido a que las pruebas tradicionales de cultivo para bacterias indicadoras de contaminación fecal (BIF) son fáciles y económicas, se han utilizado durante más de 60 años como indicadores de la posible presencia de patógenos en las heces. No obstante, la comunidad científica reconoce desde hace tiempo que existen serias limitaciones cuando estas pruebas se utilizan como indicadores estrictos de contaminación fecal en muestras de agua. Estas limitaciones se agravan cuando se utilizan BIF de cultivo para el análisis de muestras superficiales o a granel en ambientes interiores.

La Agencia de Protección Ambiental (EPA), el Servicio Geológico de los Estados Unidos (USGS) y numerosos investigadores de todo el mundo están llevando a cabo investigaciones sobre nuevos métodos indicadores utilizando métodos rápidos en lugar de pruebas de cultivo. El más prometedor hasta la fecha ha sido el uso de la tecnología qPCR para detectar la cantidad total de bacterias. Bacteroides, humano Bacteroides, y los poliomavirus humanos (HPyV), que han demostrado ser altamente específicos y sensibles para esta aplicación. Según los estudios, no existe asociación, o como mucho una débil, entre la presencia o ausencia de estos nuevos indicadores y los recuentos de las pruebas de FIB en cultivo. En otras palabras, las pruebas de FIB en cultivo tienen un alto porcentaje de resultados falsos positivos y falsos negativos, mientras que Bacteroides Las especies son altamente específicas para la contaminación fecal, y los HPyV son altamente específicos para la contaminación fecal humana.

Bacteroides son bacterias anaeróbicas que predominan en las heces de mamíferos y algunas aves. Las estimaciones indican que Bacteroides están presentes en enormes concentraciones en las heces (¡100.000.000.000 células por gramo de heces secas!), superando con creces en número a los coliformes, E. coli, o Enterococcus concentraciones. Desde Bacteroides No pueden sobrevivir en presencia de oxígeno, no persisten ni se multiplican fuera del intestino como los FIB. Bacteroides solo están presentes en la contaminación fecal, a diferencia de algunos coliformes que son bacterias transmitidas por el suelo y E. coli y algunos Enterococcus especies que pueden no ser específicas de la contaminación fecal (es decir, E. coli se pueden encontrar en aguas limpias y sedimentos en latitudes tropicales, y algunos Enterococos son transmitidas por el suelo). Bacteroides’La naturaleza anaeróbica es una ventaja al analizar aguas residuales o contaminación fecal. Debido a que la PCR detecta el material genético (en este caso, ADN) y no depende del cultivo de organismos vivos, estas pruebas no requieren envíos especiales ni tienen tiempos de espera particularmente cortos. Además, la prueba es muy sensible en comparación con FIBS. Por lo tanto, la naturaleza anaeróbica de Bacteroides, sus enormes concentraciones en las heces, y la sensibilidad y especificidad de la qPCR hacen que las pruebas para estas bacterias sean más fáciles y efectivas que el uso de pruebas de cultivo de FIB. (Existen pruebas de qPCR para E. coli y Enterococos pero debido a las concentraciones relativamente bajas de estas bacterias en las heces, es posible que no se detecten si la muestra fecal está diluida.

Diferentes tipos de la Bacteroides Existen bacterias que permiten a los analistas realizar pruebas para detectar tipos específicos de contaminación. Un tipo, llamado contaminación total Bacteroides, abarca fuentes de mamíferos, algunas aves y humanos. Debido a la sensibilidad de la totalidad Bacteroides Para la prueba qPCR, es fundamental incluir muestras de referencia de áreas que no estén contaminadas ni afectadas por aguas residuales o heces. (Esta prueba incluso puede detectar la contaminación cruzada fecal proveniente de zapatos sucios y cabezales de fregona).

Otro tipo de prueba qPCR, Humana Bacteroides, Esta prueba es principalmente específica para muestras humanas, ya que se centra en marcadores genéticos humanos. En la práctica, esto significa que los resultados pueden interpretarse con un alto grado de confianza, puesto que se trata de una prueba específica para material fecal humano.

La evidencia sugiere que los HPyV son incluso más específicos que los Bacteroides humanos. Bacteroides Los virus HPyV se diferencian en que el primero se encuentra en las heces, mientras que los HPyV solo se encuentran en la orina humana. Dado que la orina y las heces se excretan juntas, este virus se encuentra en altas concentraciones en aguas residuales y alcantarillado urbano. Además, los HPyV son buenos indicadores de contaminación fecal humana y útiles para el rastreo de fuentes microbianas, ya que no se encuentran en la escorrentía de la agroindustria ni de las explotaciones ganaderas intensivas. (Nota: Los HPyV estarán presentes en la escorrentía de las explotaciones agrícolas en países en desarrollo donde se utilizan excrementos humanos o aguas residuales como fertilizante o donde las prácticas de saneamiento son deficientes).

Los HPyV no se encuentran en aguas superficiales donde no hay un impacto humano conocido, ni se encuentran en muestras de desechos lácteos, avícolas o porcinos (todos los cuales contienen BacteroidesSegún los estudios, estos virus son exclusivos de los humanos y omnipresentes en ellos a nivel mundial. Un ser humano sano puede excretar un millón de estas partículas virales en un mililitro de orina, lo que facilita su detección. Todo esto presagia la posibilidad de una prueba exquisitamente específica y sensible para la contaminación fecal humana, incluso más que la humana. Bacteroides análisis.

A pesar de la diferencia en las fuentes, Bacteroides Los virus HPyV comparten una importante similitud: los laboratorios de análisis pueden detectarlos con gran rapidez. Dado que se utiliza la qPCR para detectar ambos indicadores, los analistas pueden examinar las muestras y proporcionar los resultados al cliente en 24 horas. Este rápido tiempo de respuesta es imposible con las pruebas de FIB basadas en cultivos, ya que las bacterias deben cultivarse antes de realizar el análisis.

Dado que los HPyV son virus y no bacterias, podrían ser excelentes indicadores de la presencia de enterovirus (virus presentes en las heces). De ser así, representaría un gran avance en la evaluación de la transmisión y prevalencia de enterovirus. Los procedimientos actuales de los Métodos Estándar de la Asociación Estadounidense de Salud Pública para enterovirus son muy laboriosos y requieren la recolección de muestras de gran volumen (100-1500 litros). Esto complica el proceso de análisis, ya que la normativa vigente del Departamento de Transporte de EE. UU. (DOT) prohíbe el transporte interestatal de material biopeligroso de más de 4 litros. En respuesta a esta normativa, las muestras suelen filtrarse en el campo y los filtros se envían al laboratorio. Estos pasos generan un riesgo considerable de contaminación de las muestras, lo cual podría evitarse si se utilizaran los HPyV como indicadores.

Dado que ahora existe una variedad de pruebas disponibles para detectar la contaminación fecal, la pregunta es: "¿Cómo elegir entre las pruebas?".“

Si su preocupación es la contaminación por aguas superficiales, aguas de río o aguas pluviales después de una inundación, total Bacteroides es la mejor opción ya que la escorrentía de las calles (excremento de perro), la escorrentía contaminada con estiércol de las operaciones agrícolas y los desbordamientos de las plantas de tratamiento combinado (tanto de aguas residuales como pluviales) son motivo de preocupación. En esta situación, existe el potencial de enfermedades humanas causadas por fuentes de contaminación tanto animales como humanas. Total Bacteroides indicará la presencia de todos estos contaminantes potenciales.

El humano Bacteroides La prueba es la mejor opción si su problema es un inodoro atascado o un desbordamiento de la red de alcantarillado sanitario (que solo gestiona desechos humanos). El uso de Bacteroides humanos prácticamente elimina cualquier contaminación residual proveniente de mascotas.

Bacteroides Puede utilizarse para el muestreo ambiental superficial o masivo en interiores, así como para muestras de agua, aguas residuales y suelo no autorizadas, con fines de investigación o investigación, ya que no existen permisos estipulados ni requisitos legales.

Sin embargo, si está tomando muestras de agua potable, agua recreativa o efluentes de aguas residuales como parte de una evaluación de cumplimiento para una condición de permiso regulada del Sistema Nacional de Prevención y Eliminación de Descargas (NPDES), aún debe utilizar métodos FIB dependientes de cultivo para coliformes, E. coli o enterococos.

Hasta la fecha, las investigaciones se han realizado utilizando pruebas PCR de HPyVs para determinar la contaminación fecal humana en agua y aguas residuales únicamente. Dado que su uso no se ha validado para muestras superficiales, de suelo o sedimentos, el muestreo para estas muestras debería limitarse a muestras superficiales y de aguas residuales. La ventaja de utilizar HpyVs en este caso radica en la eliminación completa de la contaminación de fondo por materia fecal animal.

En resumen, las ventajas de utilizar pruebas de PCR en lugar de cultivos de FIB son:

1. Las pruebas de FIB de cultivo actuales tienen un alto porcentaje de falsos positivos y falsos negativos, mientras que el total Bacteroides son específicos para la contaminación fecal.
2. A diferencia de las pruebas de enriquecimiento cualitativas para detectar FIBS en bajas concentraciones, estas pruebas de PCR son cuantitativas incluso a bajos niveles de contaminación fecal.
3. Humano Bacteroides y los HpyV son específicos solo para la contaminación fecal humana. Los FIB de cultivo actuales no pueden distinguir entre fuentes de contaminación fecal humanas o animales.
4. Los resultados pueden obtenerse horas después de recibir las muestras, lo que permite el cierre del edificio y el inicio de las labores de saneamiento sin una demora significativa.
5. Los resultados pueden interpretarse con un alto grado de confianza, ya que las pruebas de PCR, cuando se realizan correctamente, eliminan los resultados falsos positivos y negativos que son comunes en las pruebas de cultivo de FIB.