Utilisation de la qPCR pour détecter la contamination des eaux usées

Les hygiénistes industriels et les professionnels de la santé environnementale sont fréquemment sollicités pour déterminer la présence d'une contamination fécale après des débordements d'égouts et des inondations dues à des orages. Nombre d'entre eux ont recours aux tests traditionnels de recherche de bactéries indicatrices de contamination fécale (FIB), qui consistent à cultiver les coliformes totaux et les coliformes fécaux., E. coli, ou Entérocoques Pour ces applications, bien qu'il soit largement admis que ces tests ne sont ni suffisamment spécifiques ni suffisamment sensibles pour être considérés comme de bons indicateurs de contamination fécale, ils étaient les seuls disponibles jusqu'à récemment. Grâce à la commercialisation de la réaction en chaîne par polymérase (en particulier la PCR quantitative ou qPCR), aux tests génomiques et aux recherches complémentaires sur l'utilisation d'autres organismes indicateurs de contamination fécale, nous disposons désormais de tests plus sensibles et spécifiques pour déterminer la présence de contamination fécale ou d'eaux usées.

Les matières fécales contiennent une quantité extraordinaire de micro-organismes : bactéries, virus, protozoaires et helminthes, dont certains sont pathogènes. Cependant, il est techniquement impossible de cultiver tous les types d’organismes pathogènes présents dans les matières fécales, et le coût serait prohibitif. Les tests traditionnels de détection des indicateurs de contamination fécale (ICF) par culture étant simples et peu coûteux, ils sont utilisés depuis plus de 60 ans comme indicateurs de la présence potentielle de pathogènes dans les matières fécales. Néanmoins, la communauté scientifique reconnaît depuis longtemps les sérieuses limites de ces tests lorsqu’ils sont utilisés comme indicateurs fiables de contamination fécale dans les échantillons d’eau. Ces limites sont encore plus marquées lorsque les ICF par culture sont utilisés pour l’analyse d’échantillons de surface ou de grande quantité dans les environnements intérieurs.

L'Agence de protection de l'environnement (EPA), l'Institut d'études géologiques des États-Unis (USGS) et de nombreux chercheurs à travers le monde mènent des recherches sur de nouvelles méthodes d'indicateurs utilisant des techniques rapides plutôt que des cultures. L'utilisation de la technologie qPCR pour le dépistage de la virulence totale s'est avérée la plus prometteuse à ce jour. Bactéroïdes, humain Bactéroïdes, et les polyomavirus humains (HPyV), qui se sont révélés très spécifiques et sensibles pour cette application. Selon les études, il n'existe aucune association, ou tout au plus une association faible, entre la présence ou l'absence de ces nouveaux indicateurs et les résultats des tests FIB en culture. En d'autres termes, les tests FIB en culture présentent un pourcentage élevé de faux positifs et de faux négatifs, tandis que Bactéroïdes Les espèces sont très spécifiques à la contamination fécale, et les HPyV sont très spécifiques à la contamination fécale humaine.

Bactéroïdes Ce sont des bactéries anaérobies qui prédominent dans les fèces des mammifères et de certains oiseaux. Les estimations indiquent que Bactéroïdes sont présentes en concentrations énormes dans les matières fécales (100 000 000 000 cellules par gramme de matières fécales sèches !) – bien plus nombreuses que les coliformes, E. coli, ou Entérocoques concentrations. Puisque Bactéroïdes Ils ne peuvent survivre en présence d'oxygène, ils ne persistent ni ne se multiplient en dehors de l'intestin comme les fibroblastes intestinaux. Bactéroïdes ne sont présents que dans les matières fécales contaminées – contrairement à certaines coliformes qui sont des bactéries présentes dans le sol et E. coli et certains Entérocoques espèces qui peuvent ne pas être spécifiques à la contamination fécale (c.-à-d., E. coli On peut les trouver dans les eaux claires et les sédiments des latitudes tropicales, et certains Entérocoques sont transportés par le sol). Bactéroïdes’Le caractère anaérobie de la PCR est un atout majeur pour la détection de la contamination fécale ou des eaux usées. Comme la PCR détecte le matériel génétique (ici, l'ADN) sans nécessiter la culture de micro-organismes vivants, ces tests ne requièrent ni transport spécial ni délais d'attente particulièrement courts. De plus, le test est très sensible comparé à la FIBS. Par conséquent, le caractère anaérobie de la PCR est un avantage considérable. Bactéroïdes, Leur concentration élevée dans les selles, ainsi que la sensibilité et la spécificité de la qPCR, rendent le dépistage de ces bactéries plus simple et plus efficace que les tests de culture FIB. (Il existe des tests qPCR pour E. coli et Entérocoques mais en raison des concentrations relativement faibles de ces bactéries dans les matières fécales, elles peuvent ne pas être détectées si la matière fécale est diluée.)

Différents types de Bactéroïdes Des bactéries existent, permettant aux analystes de détecter des types spécifiques de contamination. L'un d'eux, appelé contamination totale, en est un exemple. Bactéroïdes, englobe des sources mammifères, certaines sources aviaires et humaines. En raison de la sensibilité de l'ensemble Bactéroïdes Pour le test qPCR, il est crucial d'inclure des échantillons de fond provenant de zones non contaminées ou non impactées par des eaux usées ou des matières fécales. (Ce test peut même détecter une contamination croisée fécale par des chaussures sales ou des têtes de balai-serpillière.)

Un autre type de test qPCR, humain Bactéroïdes, Ce test est largement spécifique aux sources humaines puisqu'il cible des marqueurs génétiques humains. Concrètement, cela signifie que les résultats peuvent être interprétés avec un haut degré de fiabilité, car ce test est spécifique aux matières fécales humaines.

Des éléments indiquent que les HPyV sont encore plus spécifiques que les Bacteroides humains. Bactéroïdes Les HPyV et les cysticénites humaines (HPyV) se distinguent par leur localisation : les HPyV se trouvent dans les matières fécales, tandis que les HPyV se trouvent uniquement dans l’urine humaine. Comme l’urine et les matières fécales sont excrétées ensemble, ce virus est présent en fortes concentrations dans les eaux usées et les égouts urbains. De plus, les HPyV sont de bons indicateurs de contamination fécale humaine et utiles pour le traçage des sources microbiennes, car ils ne sont pas présents dans les eaux de ruissellement issues de l’agro-industrie ou des élevages intensifs. (Remarque : les HPyV seront présents dans les eaux de ruissellement issues des activités agricoles des pays en développement où les excréments humains, ou “ eaux noires ”, sont utilisés comme engrais ou lorsque les pratiques d’assainissement sont insuffisantes.)

Les HPyV ne sont pas présents dans les eaux de surface où aucun impact humain n'est connu, ni dans les échantillons de déchets laitiers, de volaille ou de porc (qui contiennent tous des HPyV). BactéroïdesD'après les études, ces virus sont spécifiques à l'espèce humaine et omniprésents chez l'être humain à travers le monde. Un individu en bonne santé peut excréter un million de ces particules virales dans un millilitre d'urine, ce qui facilite leur détection. Tout cela laisse entrevoir la possibilité d'un test extrêmement spécifique et sensible pour la contamination fécale humaine, encore plus performant que le test humain. Bactéroïdes analyse.

Malgré la différence des sources, Bactéroïdes Les HPyV et les HPyV partagent une similitude importante : les laboratoires d’analyse peuvent les détecter très rapidement. La qPCR étant utilisée pour rechercher les deux indicateurs, les analystes peuvent examiner les échantillons et fournir les résultats au client en 24 heures. Ce délai d’exécution rapide est impossible avec les tests de détection des FIB basés sur la culture, car les bactéries doivent être cultivées avant même l’analyse.

Comme les HPyV sont des virus et non des bactéries, ils pourraient également s'avérer d'excellents indicateurs de la présence d'entérovirus (virus présents dans les selles). Si tel est le cas, cela représenterait une avancée majeure pour l'évaluation de la transmission et de la prévalence des entérovirus. Les procédures actuelles de l'American Public Health Association (APA) relatives aux méthodes standardisées pour les entérovirus sont très laborieuses et nécessitent le prélèvement d'échantillons de très grande taille (100 à 1 500 litres). Ce facteur complique le processus d'analyse, car la réglementation actuelle du Département des Transports des États-Unis (DOT) interdit le transport interétatique de matières biologiques dangereuses en volumes supérieurs à 4 litres. En conséquence, les échantillons sont souvent filtrés sur le terrain, puis les filtres sont expédiés au laboratoire. Ces étapes augmentent considérablement les risques de contamination des échantillons, risques qui pourraient être évités si les HPyV étaient utilisés comme indicateurs.

Puisqu'il existe désormais divers tests de dépistage de la contamination fécale, la question qui se pose est : “ Comment choisir entre ces tests ? ”

Si votre préoccupation concerne la contamination par les eaux de surface, les eaux fluviales ou les eaux pluviales après une inondation, le total Bactéroïdes est le meilleur choix car le ruissellement des rues (déjections canines), le ruissellement contaminé par le fumier provenant des activités agricoles et les débordements des stations d'épuration unitaires (eaux usées et pluviales) sont préoccupants. Dans ce cas, il existe un risque de maladies humaines causées par des sources de contamination animales et humaines. Total Bactéroïdes indiquera la présence de tous ces contaminants potentiels.

L'humain Bactéroïdes Le test est la meilleure option si vous craignez un refoulement des toilettes ou un débordement du réseau d'égouts (qui ne traite que les eaux usées humaines). L'utilisation de Bacteroides d'origine humaine élimine pratiquement toute contamination par les animaux domestiques.

Bactéroïdes peut être utilisé pour l'échantillonnage de surface ou en vrac de l'environnement intérieur, des échantillons d'eau, d'eaux usées et de sol non autorisés, à des fins d'investigation ou de recherche, puisqu'il n'existe aucun permis stipulé ni aucune exigence légale.

Toutefois, si vous prélevez des échantillons d'eau potable, d'eau de loisirs ou d'effluents d'eaux usées dans le cadre d'une évaluation de conformité à une condition de permis réglementée du Système national de prévention et d'élimination des rejets (NPDES), vous êtes toujours tenu d'utiliser des méthodes FIB dépendantes de la culture pour les coliformes, E. coli ou les entérocoques.

À ce jour, les recherches utilisant les tests PCR HPyV ont été limitées à la détection de la contamination fécale humaine dans l'eau et les eaux usées. Leur utilisation n'ayant pas été validée pour les échantillons de surface, de sol ou de sédiments, l'échantillonnage de ces derniers devrait être restreint aux eaux de surface et aux eaux usées. L'avantage de l'utilisation des HPyV dans ce cas précis réside dans l'élimination complète de la contamination de fond par des matières fécales animales.

En résumé, les avantages de l’utilisation des tests PCR au lieu des FIB de culture sont les suivants :

1. Les tests FIB de culture actuels présentent un pourcentage élevé de faux positifs et de faux négatifs, tandis que le total Bactéroïdes sont spécifiques à la contamination fécale.
2. Contrairement aux tests d'enrichissement qualitatifs permettant de détecter les FIBS à de faibles concentrations, ces tests PCR sont quantitatifs même à de faibles niveaux de contamination fécale.
3. Humain Bactéroïdes Les HpyV sont spécifiques de la contamination fécale humaine uniquement. Les FIB de culture actuels ne permettent pas de distinguer les sources de contamination fécale humaines et animales.
4. Les résultats peuvent être obtenus quelques heures après la réception des échantillons, ce qui permet de fermer le bâtiment et de commencer les travaux de dépollution sans délai important.
5. Les résultats peuvent être interprétés avec un degré de confiance élevé puisque les tests PCR, lorsqu'ils sont effectués correctement, éliminent les faux positifs et les faux négatifs qui sont fréquents avec les tests de culture FIB.