Utilizando qPCR para detectar contaminação por esgoto

Higienistas industriais e profissionais de saúde ambiental são frequentemente solicitados a determinar a presença de contaminação fecal após transbordamentos de esgoto e inundações causadas por tempestades. Muitos utilizam os testes tradicionais de bactérias indicadoras fecais (FIBs), que cultivam coliformes totais, coliformes fecais, E. coli, ou Enterococos para essas aplicações. Embora seja amplamente reconhecido que esses testes não são específicos nem sensíveis o suficiente para serem considerados bons indicadores de contaminação fecal, eles eram os únicos testes disponíveis até recentemente. Com a comercialização da Reação em Cadeia da Polimerase (especificamente a Reação em Cadeia da Polimerase quantitativa ou qPCR), testes genômicos e pesquisas adicionais sobre o uso de outros organismos indicadores de contaminação fecal, agora temos testes mais sensíveis e específicos para determinar a presença de contaminação fecal ou de esgoto.

As fezes contêm uma quantidade extraordinária de microrganismos: bactérias, vírus, protozoários e helmintos — alguns dos quais são patogênicos. No entanto, não é tecnicamente possível cultivar todos os tipos de organismos patogênicos presentes nas fezes, e fazê-lo seria proibitivamente caro. Como os testes tradicionais de cultura para indicadores de contaminação fecal (ICF) são fáceis e baratos, eles têm sido usados há mais de 60 anos como indicadores da possível presença de patógenos nas fezes. Contudo, a comunidade científica reconhece há bastante tempo que existem sérias limitações quando esses testes são usados como indicadores rigorosos de contaminação fecal em amostras de água. Essas limitações se agravam quando os ICF cultivados são usados para análise de amostras superficiais ou em massa em ambientes internos.

A Agência de Proteção Ambiental (EPA), o Serviço Geológico dos Estados Unidos (USGS) e inúmeros pesquisadores em todo o mundo estão conduzindo pesquisas sobre novos métodos indicadores que utilizam métodos rápidos em vez de testes de cultura. O mais promissor até o momento tem sido o uso da tecnologia qPCR para testar a presença total de bactérias. Bacteroides, humano Bacteroides, e poliomavírus humanos (HPyVs), que demonstraram ser altamente específicos e sensíveis para essa aplicação. De acordo com estudos, não existe associação, ou no máximo uma fraca, entre a presença ou ausência desses novos indicadores e a contagem dos testes de cultura FIB. Em outras palavras, os testes de cultura FIB apresentam uma alta porcentagem de resultados falso-positivos e falso-negativos, enquanto Bacteroides As espécies são altamente específicas para contaminação fecal, e os HPyVs são altamente específicos para contaminação fecal humana.

Bacteroides São bactérias anaeróbicas que predominam nas fezes de mamíferos e de algumas aves. Estimativas indicam que Bacteroides estão presentes em concentrações enormes nas fezes (100.000.000.000 células por grama de fezes secas!) – superando em muito o número de coliformes., E. coli, ou Enterococcus concentrações. Desde Bacteroides Não conseguem sobreviver na presença de oxigênio, não persistem nem se multiplicam fora do intestino como os FIBs. Bacteroides estão presentes apenas na contaminação fecal – ao contrário de alguns coliformes, que são bactérias presentes no solo e E. coli e alguns Enterococcus espécies que podem não ser específicas para contaminação fecal (ou seja, E. coli Podem ser encontrados em águas limpas e sedimentos em latitudes tropicais, e alguns Enterococos são transmitidas pelo solo). Bacteroides’A natureza anaeróbica do teste é uma grande vantagem na detecção de contaminação fecal ou de esgoto. Como a PCR detecta o material genético (neste caso, o DNA) e não depende do cultivo de organismos vivos, esses testes não exigem transporte especial nem têm prazos de entrega particularmente curtos. Além disso, o teste é muito mais sensível do que o FIBS. Portanto, a natureza anaeróbica do teste é uma grande vantagem. Bacteroides, suas enormes concentrações nas fezes, e a sensibilidade e especificidade do qPCR tornam o teste para essas bactérias mais fácil e eficaz do que o uso de culturas de FIB. (Existem testes de qPCR para E. coli e Enterococos Mas, devido às concentrações relativamente baixas dessas bactérias nas fezes, elas podem não ser detectadas se o material fecal for diluído.

Diferentes tipos de Bacteroides Existem bactérias que permitem aos analistas testar tipos específicos de contaminação. Um desses tipos é chamado de contaminação total. Bacteroides, abrange fontes mamíferas, algumas aviárias e humanas. Devido à sensibilidade do total Bacteroides Para realizar o teste qPCR, é crucial incluir amostras de fundo de áreas que não estejam contaminadas ou afetadas por esgoto ou fezes. (Este teste pode detectar até mesmo contaminação cruzada fecal proveniente de sapatos sujos e esfregões.)

Outro tipo de teste qPCR, Humano Bacteroides, O teste é amplamente específico para amostras de origem humana, uma vez que se concentra em marcadores genéticos humanos. Na prática, isso significa que os resultados podem ser interpretados com um alto grau de confiança, já que o teste é específico para material fecal humano.

As evidências sugerem que os HPyVs são ainda mais específicos do que os Bacteroides humanos. Bacteroides Os HPyVs diferem entre si pelo fato de os primeiros serem encontrados nas fezes, enquanto os HPyVs são encontrados apenas na urina humana. Como urina e fezes são excretadas juntas, esse vírus é encontrado em altas concentrações em águas residuais e esgoto urbano. Além disso, os HPyVs são bons indicadores de contaminação fecal humana e úteis no rastreamento da origem microbiana, uma vez que não estão presentes no escoamento de atividades agropecuárias ou confinamento de gado. (Observação: os HPyVs estarão presentes no escoamento de atividades agrícolas em países em desenvolvimento onde excrementos humanos ou "água negra" são usados como fertilizante ou onde as práticas de saneamento são precárias.)

Os HPyVs não são encontrados em águas superficiais onde não há impacto humano conhecido, nem em amostras de dejetos de laticínios, aves ou suínos (todos os quais contêm BacteroidesDe acordo com estudos, esses vírus são exclusivos dos humanos e onipresentes em humanos no mundo todo. Um ser humano saudável pode excretar um milhão dessas partículas virais em um mililitro de urina, facilitando a detecção. Tudo isso indica a possibilidade de um teste extremamente específico e sensível para contaminação fecal humana — ainda mais específico do que o teste para detecção de contaminação fecal humana. Bacteroides análise.

Apesar da diferença nas fontes, Bacteroides Os HPyVs e os HPyVs compartilham uma importante semelhança: os laboratórios de análise podem detectá-los muito rapidamente. Como a qPCR é usada para testar ambos os indicadores, os analistas podem examinar as amostras e fornecer os resultados ao cliente em até 24 horas. Esse rápido tempo de resposta é impossível com os testes de FIBs baseados em cultura, pois as bactérias precisam ser cultivadas antes mesmo da análise.

Como os HPyVs são vírus e não bactérias, eles também podem se revelar excelentes indicadores da presença de enterovírus (vírus encontrados nas fezes). Se isso se confirmar, representaria um enorme avanço na avaliação da transmissão e prevalência de enterovírus. Os procedimentos atuais dos Métodos Padrão da Associação Americana de Saúde Pública (APHA) para enterovírus são muito trabalhosos e exigem a coleta de amostras de grande volume (100 a 1500 litros). Esse fato complica o processo de teste, pois as regulamentações atuais do Departamento de Transportes dos EUA (DOT) proíbem o transporte interestadual de material bio-perigoso em volumes superiores a 4 litros. Em resposta a essas regulamentações, as amostras são frequentemente filtradas em campo e os filtros são enviados ao laboratório. Essas etapas criam consideráveis oportunidades de contaminação das amostras, o que poderia ser evitado se os HPyVs fossem utilizados como indicadores.

Como atualmente existem diversos testes disponíveis para detectar contaminação fecal, a questão que surge é: "Como escolher entre os testes?"“

Se sua preocupação for a contaminação por água superficial, água de rio ou água pluvial após uma inundação, total Bacteroides é a melhor opção, visto que o escoamento de ruas (fezes de cachorro), o escoamento contaminado com esterco proveniente de atividades agrícolas e os transbordamentos combinados (tanto de esgoto sanitário quanto de águas pluviais) são preocupantes. Nessa situação, existe o potencial de doenças em humanos causadas por fontes de contaminação tanto de origem animal quanto humana. Total Bacteroides indicará a presença de todos esses potenciais contaminantes.

O ser humano Bacteroides O teste é a melhor opção se sua preocupação for um vaso sanitário entupido ou um refluxo/transbordamento da rede de esgoto (que lida apenas com dejetos humanos). O uso de Bacteroides humanos elimina praticamente qualquer contaminação de fundo proveniente de animais de estimação.

Bacteroides Pode ser utilizado para amostragem ambiental interna de superfície ou em massa, amostras de água, águas residuais e solo não autorizadas, investigativas ou voltadas para pesquisa, uma vez que não há licenças estipuladas ou requisitos legais.

No entanto, se você estiver coletando amostras de água potável, água recreativa ou efluentes de esgoto como parte de uma avaliação de conformidade para uma condição regulamentada pelo Sistema Nacional de Prevenção e Eliminação de Descargas (NPDES), ainda será necessário usar métodos de cultura dependentes de indicadores de contaminação fecal (FIB) para coliformes, E. coli ou enterococos.

Até o momento, as pesquisas com testes de PCR para HPyVs foram realizadas apenas para determinar a contaminação fecal humana em água e esgoto. Como seu uso não foi validado para amostras de superfície, solo ou sedimentos, a amostragem para esses fins deve ser restrita a amostras de superfície e esgoto. A vantagem de usar HPyVs nesse caso é a eliminação completa da contaminação de fundo por material fecal animal.

Em resumo, as vantagens de usar testes de PCR em vez de culturas de FIBs são:

1. Os testes atuais de cultura FIB apresentam uma alta porcentagem de resultados falso-positivos e falso-negativos, enquanto o total Bacteroides são específicas para contaminação fecal.
2. Ao contrário dos testes de enriquecimento qualitativos para detecção de FIBS em baixas concentrações, esses testes de PCR são quantitativos mesmo em baixos níveis de contaminação fecal.
3. Humano Bacteroides Os HpyVs são específicos apenas para contaminação fecal humana. Os FIBs de cultura atuais não conseguem distinguir entre fontes humanas ou animais de contaminação fecal.
4. Os resultados podem ser obtidos horas após o recebimento das amostras, permitindo o fechamento do edifício e o início dos trabalhos de remediação sem atrasos significativos.
5. Os resultados podem ser interpretados com um alto grau de confiança, uma vez que os testes de PCR, quando realizados corretamente, eliminam os resultados falso-positivos e falso-negativos que são comuns nos testes de cultura FIB.